Основные технологии производства днк-микрочипов. Методы днк-чипов Пример использования ДНК-микрочипа
ДНК-микрочип - это как правило небольшая отполированная кремниевая пластина, на поверхности которой закреплены специальные ДНК-зонды. Именно зонды отвечают за распознавание ДНК. Зонд - это небольшой искусственно синтезированный участок ДНК, который нацелен на выявление одной единственной мутации. На чипах разных производителей от нескольких сотен до нескольких миллионов зондов, и каждый представляет уникальную мутацию.
Перед анализом на чипе ДНК выделяют, например, из слюны, очищают от посторонних веществ и нарезают на небольшие фрагменты.
Затем раствор с этими фрагментами наносят на чип и оставляют на время. Эта стадия называется инкубацией. В течение этого времени фрагменты исследуемой ДНК проникают между зондами на чипе, и далее процесс может пойти по двум путям. В одном случае, если последовательность фрагмента ДНК зеркальна (комплементарна) по отношению к последовательности ДНК зонда, произойдет слипание (гибридизация), потому что комплементарные участки ДНК подходят друг к другу как края застежки-молнии. Если же фрагмент похож на зонд лишь отчасти или не похож вообще, гибридизации не произойдет и он продолжит свободно плавать между зондами.
После инкубации наступает стадия отмывки, призванная удалить несвязанные фрагменты с чипа. При этом удаляются не только свободные фрагменты, но и те, которые загибридизовались лишь частично. Если гибридизация происходит частично, значит фрагмент не полностью подошел в зонду и его нужно убрать. Полностью комплементарные фрагменты ДНК настолько хорошо держатся за зонд, что не смываются на этой стадии.
После отмывки на чипе остаются зонды, связанные с участками ДНК человека, и свободные зонды.
На финальной стадии происходит выявление тех зондов, с которыми связались фрагменты исследуемой ДНК. Здесь подходы различаются. Например, на чип наносится специальная светящаяся метка, которая прочно соединяется только со "сработавшими" зондами. Несвязанные метки снова отмываются, а затем чип фотографируется под микроскопом. Получается сетка из множества разноцветных точек с разной яркостью. Зная, в какой точке какой зонд расположен, можно понять, какие именно последовательности ДНК есть у человека, то есть какими мутациями он обладает.
Исследуемую ДНК нарезают специальными ферментами, рестриктазами, которые распознают в последовательности нуклеотидов особые сочетания и режут по ним. Эти особые сочетания нуклеотидов разбросаны по ДНК достаточно равномерно, поэтому фрагменты получаются достаточно однородными по длине.
Равномерность нанесения на чип достигается тем, что фрагменты наносятся в виде раствора. А в нем уже тепловое (броуновское) движение распределяет моелкулы равномерно. Остается нанести каплю раствора на на то место чипа, где находятся зонды. А это не сложно - обычно такое окно на чипе имеет размеры не более 10х10 мм.
Ответить
Прокомментировать
Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют -microarrays, - это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века.
Введение
Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Технология микрочипов – это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно. На основании экспериментальных данных сотрудниками лаборатории клеточной инженерии под руководством д.б.н. Белецкого И. П. Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики (г. Пущино Московская обл.) была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов, а также их использования при гибридизационном анализе ДНК. В его основе лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Биочипы используются для самых разных целей. В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза и лейкоза, а так же некоторые виды раковых заболеваний. Биочипы являются незаменимым инструментом для биологов, которые могут сразу, за один эксперимент, увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.
Биохимические микрочипы
Биохимические микрочипы, технологии производства и внедрения которых активно развиваются в России и за рубежом, являются сильнейшими из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.
К главным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и др.
ДНК-микрочипы
ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.
Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.
ДНК–чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото. Наиболее распространенные подложки – из стекла.
Белковые и пептидные чипы
Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции.Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов – РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток – ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97. Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами - природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др.
Углеводные микрочипы
Многие природные биомолекулы (белки, липиды) модифицированы сахарными остатками. Часто биологические процессы включают связывание сахаров с рецепторами, и микрочипы могут стать важным инструментом в исследовании таких взаимодействий. Гликолипиды, нанесенные на нитроцеллюлозу или поливинилиденфторид, представляют пример углеводных микрочипов. Эти гликолипиды взаимодействуют с белками с известной углевод-связывающей специфичностью для подтверждения предсказанных олигосахарид-белковых взаимодействий. Связывание углеводов с мембранами регистрируют с помощью флуоресцентно меченых гликолипидов. Углеводный состав связавшегося компонента определяют in situ масс-спектрометрически. Важно отметить, что олигосахариды, связанные с липидом, могут иметь различное происхождение, например, гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды, целые клетки и синтетические олигосахариды. Таким образом, по взаимодействию олигосахаридов, последовательность которых известна, с мембраной могут быть идентифицированы конкретные связанные с сахарами белковые мотивы. И, наоборот, путем связывания неизвестных олигосахаридов с мембраной можно отобрать белки с известной структурой, чтобы определить, с какими олигосахаридами они связаны.
Тканевые микрочипы
Данные по анализу экспрессии генов только начинают давать нам важную информацию о биологической функции генов, их потенциальном клиническом влиянии или их пригодности в качестве мишени для лекарства. В то же время традиционный гистологический анализ образцов ткани требует больших затрат времени: ткани выдерживают в формалине, помещают в парафин, делают срезы и только затем красят и проводят микроскопический анализ на индивидуальных стеклах. В 1998 году для такого анализа впервые были изготовлены тканевые микрочипы посредством нанесения на одну подложку многих образцов ткани.
Изготовление микрочипа включает объединение до тысячи иголочных биопсий, взятых из помещенных в парафин образцов ткани, в парафиновом блоке с определенными координатами. Из этого блока делается до 300 срезов, которые переносятся на стекло для прокрашивания и анализа. Таким образом, из одного блока может быть произведено до 300 тысяч анализов. При этом такой способ вызывает минимальное повреждение ткани.
Приготовленные один раз, микрочипы могут быть испытаны на взаимодействие с различными молекулярными мишенями – ДНК, РНК или белками – в сотнях или даже тысячах образцах ткани. Принципиальное отличие тканевых чипов от, например, ДНК-чипов заключается в том, что в последнем случае определяется экспрессия тысяч генов в одной ткани/образце, тогда как в первом – один ген в тысяче различных тканей/образцов. Преимущество анализа с использованием тканевых микрочипов состоит в том, что все образцы ткани обрабатываются одинаковым способом, т.е. концентрации реагентов, время инкубации, температура и состав растворов неизменны. При этом для анализа требуется всего десятые или сотые доли миллилитра реагентов.
Тканевые микрочипы довольно активно используются для поиска маркеров, ассоциированных с теми или иными заболеваниями, в первую очередь, с онкологическими. Показаны примеры успешного применения тканевых чипов для анализа аутоиммунных заболеваний, сердечной недостаточности, диабета и нейродегенеративных патологий.
Порядок проведения анализа ДНК с использованием биочипов
Олигонуклеотидный зонд, модифицированный фосфатной группой по 5-концу, пришивали к стеклу с помощью конденсирующего агента (карбодиимида в присутствии имидазола). Затем проводили гибридизацию с олигонуклеотидным фрагментом, меченным биотином, и цветную пероксидазную реакцию с помощью стрептавидин-пероксидазного конъюгата. По интенсивности окраски окисленного субстрата – диметиламинобензидина (ДАБ) – судили о результате анализа.
Изготовление биологических чипов
На основании экспериментальных данных была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов. Для широкого применения чиповых технологий необходимы простые, дешевые и эффективные методы изготовления в больших масштабах и контроля модифицированных подложек, содержащих поверхностные аминогруппы.. Наиболее часто используемыми твердыми подложками для изготовления микрочипов являются стекла, обработанные различными аминоалкилтриалкоксисиланами, например APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан, Рис.3) для получения модифицированной поверхности.
Рис.3 Структурная формула APTES. а-в свободном состоянии, б-модифицированная на стекле
Такая поверхность является гидрофобной и позволяет наносить зонды с максимальной плотностью. Как следует из литературных данных, условия получения амино-модифицированной стеклянной подложки могут быть весьма разнообразными. Это касается как концентрации APTES, так и выбора растворителя, который, в свою очередь, может содержать различное количество воды. Для изготовления амино-модифицированных подложек в больших масштабах желательно использовать как можно менее токсичные и дешевые растворители, такие как ацетон и этанол. Показано, что природа органического растворителя практически не влияет на качество получаемых стекол. Активация нуклеиновых кислот осуществляется при помощи карбодиимидов(CDI)- это один из ранних методов получения аффинных сорбентов, который до сих пор остается достаточно распространенным. В основе метода лежит способность карбодиимидов активировать концевую фосфатную группу нуклеиновых кислот. Активированные карбодиимидом олигонуклеотиды легко вступают в реакцию с амино- или сульфгидрильными группами носителей. К настоящему времени достаточно подробно изучен механизм активации карбодиимидами фосфатных групп олигонуклеотидов. Лимитирующей стадией реакции является протонирование карбодиимидов с образованием промежуточных неустойчивых реакционноспособных О-фосфорилизомочевины. Достаточно сильные нуклеофильные группы носителя могут ингибировать эту стадию
Кроме того, протонированные нуклеофильные группы не способны вступать в реакцию с соединениями 1 [Рис.4]. Вследствии этого выход конечного продукта 2 при использовании полимеров с высокоосновными группами может уменьшиться. Замещенные О-фосфорилизомочевины 3 способны также трансформироваться в побочные продукты, например гидролизоваться с высвобождением исходной фосфатной группы и мочевины, либо претерпевать ряд последовательных превращений с образованием пирофосфатов, полифосфатов и производных О-фосфорилизомочевины. Последние, в свою очередь, могут дать нереакционноспособные производные N-пирофосфорилмочевины 3 или N-фосфорилмочевины 4.
Для увеличения эффективности иммобилизации нуклеотидов на полимер активацию карбодиимидами проводят в присутствии нуклеофильного катализатора – имидазола, образующий соответствующий фосфамид олигонуклеотидов, который после протонирования остатков азола является высокореакционноспособным соединением по отношению к нуклеофилам. Чаще всего получаются фосфоимидазолиды 5 (Рис. 5)
Преимуществом этого подхода является отсутствие ряда побочных реакций, поскольку производное 5 стабильнее, чем О-фосфорилмочевина 1. Соединение 5 более эффективно взаимодействует с аминогруппой носителя, что способствует увеличению выхода при иммобилизации.
Проведение гибридизации.
В основе гибридизационного анализа лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов (Рис.6,б). Известные в настоящее время реакции можно разделить на две большие группы. Первая группа методов основана на амплификации – циклически повторяющейся репликации in vitro искомого фрагмента ДНК (РНК). Амплифицированный фрагмент затем выявляется путем электрофореза в геле. Ко второй группе относятся методы прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу (зонд). Эти реакции получили название ДНК-зондирования. Их чувствительность зависит от вида используемого зонда и может быть весьма высокой. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов – карбоксилаз) (Рис 6,А)
Рис. 6 Схема метода гибридизационного анализа на примере идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения. А – ПЦР с использованием праймеров меченных биотином - индекс (мБ); Б – гибридизация ПЦР продуктов со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе - индекс (и)
Биотинилированное производное дУТФ (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимеразами цепи вместо тимина и способно к комплементарным взаимодействиям с аденином.
Биотин – соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте. Он является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования). Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. В большом количестве биотин содержится в белках птичьих яиц, где он связан с гликопротеидом авидином, имеющим молекулярную массу 68 кДа. Биотин обладает чрезвычайно высоким сродством к авидину, а также к его бактериальному аналогу – стрептавидину (константа диссоциации комплекса биотин-авидин 10-15 М) и образуeт чрезвычайно стойкий комплекс (КА=10 в 15-той степени на моль в минус 1-й степени).
Проведение пероксидазной реакции
Для проведения пероксидазной реакции используется коньюгат, состоящий из фермента, связанного со стрептавидином. Этот коньюгат образует очень прочный комплекс биотин-стрептавидин, который используется как связующий мостик между образовавшимся в ходе гибридизации дуплексом ДНК и ферментной меткой.
Наибольшее распространение в качестве ферментной метки получила пероксидаза хрена, которую впервые применили Накане и Пирс. Одна молекула фермента, конъюгированная со стрептавидином, способна "обработать" большое количество молекул субстрата. Под действием пероксидазы, субстрат H2O2 образует с красителем диаминобензидином (ДАБ) нерастворимый в воде и спирте комплекс коричневого цвета, который накапливается вокруг фиксированного дуплекса.
Обработка результатов анализа
Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов "EuroBioWto Биоконтроль" и компьютерной программы "MedGen". Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК). Пример схемы гибридизационной картины биологического микрочипа приведен на рис.9.
Рис. 9 Пример схемы биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождяения.PC положительный контроль, NC отрицательный контроль, Lect-ген белка сои, Zein-ген белка кукурузы, Gus, Nos, 35s, Npt, Ocs-трансгенные последовательности
Наличие яркого специфического окрашивания биологического микрочипа в местах, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и Nos, терминатора Ocs, генов Gus или NptII) , свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о трансгенности анализируемой ДНК. Отсутствие окраски после анализа указывает на отсутствие конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о нетрансгенности анализируемой ДНК. Наличие окрашивания NC cвидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты (1 моль/дм в кубе), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
Анализ с использованием биочипов находит в настоящее время широкое применение на практике. Он отличается высокой чувствительностью, простотой процедуры выполнения, возможностью одновременного анализа множества параметров, специфичностью и воспроизводимостью. Применение биологических микрочипов может быть очень эффективно в таких сферах деятельности, как: обнаружение контаминации в продуктах питания и окружающей среде, диагностика и прогнозирование заболеваний, обнаружение элементов биологического оружия, оценка лекарственной эффективности. Разработка биочиповых технологий в РФ является одной из тех высоко-технологичных областей, которой уделяется особое внимание.
Список литературы
1. Шляпникова Е. А. , Шляпников Ю. М. , Афанасьев В. Н. , Афанасьева Г. В. , Гаврюшкин А. В. , Белецкий И. П. . Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа.// Биоорганическая химия 2006 №4 С.68-86.
2. Шляпникова Е. А., Шляпников Ю. М., Грановский И. Э., Афанасьева Г. В., Гаврюшкин А. В., Белецкий И. П. "Биологические микрочипы в медицине" Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
3. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34-41.
4. Шишкина И. Г., Левина А. С., Зарытова В. Ф. "Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты" //Успехи химии// 2001. №70(6).С.581,.
5. Makretsov N.A., Huntsman D.G., Nielsen T.O., Yorida E., Peacock M., Cheang M.C., Dunn S.E., Hayes M., van de Rijn M., Bajdik C., Gilks C.B. (2004) Hierarchical clustering analysis of tissue microarray immunostaining data identifies prognostically significant groups of breast carcinoma. Clin Cancer Res., 10(18 Pt 1), 6143-6151.
6. Hu S., Loo J.A., Wong D.T. (2006) Human body fluid proteome analysis. Proteomics, 6(23), 6326-6353.
7. Ekins R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.
8. Fukui S. et al. (2002) Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat.Biotechnol.20, 1011-1017.
9. Kononen J. et al. (1998) Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumour specimens. Nat.Med. 4, 844-847/
10. Wang et al. (2002) Carbohydrate microarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microprobes and host cells. Nat.Biotechnol.20, 275-281.
11. Perkel J.M.(2002) Tissue microarrays: advancing clinical genomics. The Scientist 21, 39.
12. Helmchen B., Weckauf H., Ehemann V., Wittmann I., Meyer-Scholten C., Berger I. (2005) Expression pattern of cell cycle-related gene products in synovial stroma and synovial lining in active and quiescent stages of rheumatoid arthritis. Histol Histopathol., 20(2):365-372.
13. Hueber W., Kidd B.A., Tomooka B.H., Lee B.J., Bruce B., Fries J.F., Sonderstrup G., Monach P., Drijfhout J.W., van Venrooij W.J., Utz P.J., Genovese M.C., Robinson W.H. (2005) Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.; 52(9), 2645-2655.
14. Mobasheri A., Airley R., Foster C.S., Schulze-Tanzil G., Shakibaei M. (2004) Post-genomic applications of tissue microarrays: basic research, prognostic oncology, clinical genomics and drug discovery. Histol Histopathol., 19(1), 325-335.
15. Мелентьева Г.А.. Фармацевтическая химия. Том 2, Москва "Медицина" 1976. С.68
Гибридизационный анализ ДНК с использованием биологических микрочипов
Юная калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) - один из фаворитов рынка устройств для генетических исследовательских работ.
Компания известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», индустрии и биохимических тестов.
ДНК-чипы от Affymetrix обширно употребляются в различных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.
Но обыденным людям куда увлекательнее другой продукт компании. Это прибор, схожий на микросхему, позволяющий идентифицировать 10-ки ДНК от разных животных в образчике людской еды.
bioMerieux FoodExpert-ID практически - разновидность так именуемого GeneChip.
Прибор может идентифицировать био следы в еде от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.
Таким макаром, он позволяет выяснить, вправду ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.
ДНК-чип создаётся по технологиям, схожим с компьютерными, но это не электрический, а био объект (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).
А, например, мусульмане могут проверить - не положили ли нерадивые изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.
Всё это, правда, работает, только с привлечением дополнительных лабораторных способностей, так что использовать чип в «нагом» виде, на коленке, обычному потребителю не получится.
Чтоб осознать, как работает FoodExpert-ID, необходимо вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания - аденин, гуанин, тимин и цитозин, также то, что они могут соединяться только попарно, как будто ключи и замки.
ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.
Кусок поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).
Поверхность чипа размером с ноготь разбита на 97 тыщ квадратиков, нареченных «особенностями».
Любая «особенность» поперечником примерно 26 микронов содержит только один ДНК-код. Поточнее много-много схожих молекул.
И они все совершенно точно относятся к одному из 33 животных.
Длина каждого куска - 17 оснований. Этого довольно для надёжной идентификации, как довольно 17 взятых попорядку в любом месте нот, чтоб найти какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.
Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из эталона еды. Чего там только нет. А чего?
«Некорректные» куски генетических кодов смываются, а совпадающие - закрепляются на чипе. Красноватые шарики - флуоресцентные молекулы (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).
Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать малость.
Все совпадающие куски кода объединятся со своими «родными» последовательностями в той либо другой «особенности».
Сейчас чип можно помыть водой - всё избыточное уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко сиять. Осталось только свериться с картой чипа, чтоб выяснить - какие ДНК определены.
А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетичной котлете.
Как лицезреем, внедрение чипа сравнимо нетрудно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим очень обычный набор оборудования.
Но как же хитроумно создание чипа. Чтоб создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.
Цветные квадратики - «особенности», отвечающие за идентификацию того либо другого ДНК-кода (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).
Начальный продукт - кварцевая пластинка - покрывается особым реактивом, силаном, который крепко соединяется с кварцем и сформировывает строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.
В цепочках грядущего кода основания идут вертикально ввысь, а наносят их сразу на всю поверхность, слой за слоем.
Очевидно, всякий раз на чип подают определённое вещество, и чтоб оно закрепилось исключительно в определённых «особенностях», тех микронных квадратиках, употребляют маски, подобные тем, что необходимы для производства микросхем.
Снимок прореагировавшего чипа с огромным повышением. Белоснежные, красноватые, жёлтые квадратики - участки с высочайшей концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, голубые, чёрные - соответственно, со всё более и поболее с низкой (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).
С основой чипа всякий раз сцепляются только те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.
В этом процессе поочередного синтеза главное - всякий раз накладывать новейшую маску с микронной точностью, по другому все генетические коды на пластинке перемешаются.
Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях компании - до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и делают ключи-анализаторы генов.
Эта разработка служит, естественно, не только лишь для таких смешных (на 1-ый, может быть, взор) областей внедрения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, да и для полностью серьёзных исследований.
Ведь на поверхность чипа, на теоретическом уровне, можно нанести куски каких угодно генетических кодов.
Работа Affymetrix - избыточное подтверждение, что самые достойные внимания и многообещающие открытия происходят на соединениях наук и дисциплин.
Похоже на био обилие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?
Специфической последовательности. Олигонуклеотид может являться коротким участком гена или другого компонента ДНК, и используется для гибридизации с кДНК или мРНК. Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно определяется при помощи флюоресценции или хемолюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.
В обычном ДНК микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твердой поверхности - стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina , используют микроскопические шарики вместо больших твердых поверхностей. ДНК микрочипы отличаются от других микрочипов только тем, что их применяют для измерения ДНК или как часть более сложной системы детекции и анализа ДНК.
ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов , выявления однонуклеотидных полиморфизмов , генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов . Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.
История
Примечания
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "ДНК-микрочип" в других словарях:
Термин ДНК микрочип Термин на английском DNA microarray Синонимы ДНК чип, DNA chip, Gene сhip, DNA chip Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, геном, ДНК, ДНК зонд, лаборатория на чипе, РНК, олигонуклеотид Определение Миниатюрная пластина с… …
Термин ДНК зонд Термин на английском DNA probe Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биологические нанообъекты, биомедицинские микроэлектромеханические системы, биосенсор, геном, ДНК, ДНК микрочип, лаборатория на чипе, олигонуклеотид… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
Термин ДНК Термин на английском DNA Синонимы дезоксирибонуклеиновая кислота Аббревиатуры ДНК Связанные термины доставка генов, актуатор, бактериофаг, белки, биологические нанообъекты, биомиметика, биомиметические наноматериалы, генная инженерия,… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
ДНК-чип
ДНК-биочип - DNA Chip ДНК чип (также: ДНК биочип, ДНК микрочип, ДНК наночип) Специальный чип, используемый для выявления генетических мутаций или сдвигов, диагностики заболеваний. Биочип для американской армии, разработанный специалистами из… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.
Микрочип генный м микроматрица - Микрочип, генный м., микроматрица * мікрачып, генны м., мікраматрыца * microarray or gene chip or microchip набор из тысяч уникальных известных однонитевых фрагментов ДНК, иммобилизированных на твердую основу. Эти фрагменты представляют все… … Генетика. Энциклопедический словарь
Сэр Эдвин Мэллор Саузерн (р. 7 июня 1938) английский молекулярный биолог, член лондонского королевского общества по развитию знаний о природе (также известного как лондонское королевское общество), лауреат премии Ласкера (2005). Премия была … Википедия
ДНК микрочип, содержащий комплементарные ДНК. Комплементарная ДНК (кДНК, англ. сDNA) это ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой. кДНК ча … Википедия
Количественный анализ нуклеиновых кислот определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации… … Википедия
Термин амплификация Термин на английском amplification Синонимы Аббревиатуры Связанные термины Определение (лат. amplificatio усиление, увеличение), в молекулярной биологии увеличение числа копий ДНК. Описание В клетке амплификация происходит в… … Энциклопедический словарь нанотехнологий
В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно проводить дифференциальный сиквенс, т.е. определение точечных мутаций или полиморфизма в известных участках генома. Данные технологии имеют значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. они позволяют миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца, причем без потери чувствительности амплификационных методов. Главным преимуществом методов основанных на использовании чипов с олигонуклеотидами всех возможных нуклеотидных последовательностей данной длины, является их универсальность. Наличие на чипе олигонуклеотида любой последовательности делает возможным анализ любой исследуемой последовательности. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.
ДНК-микрочипы
Существуют белковые, ДНК, углеводные, тканеые чипы. Особого внимания заслуживают ДНК-чипы. Они представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.
Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.
ДНК–чип – это твердая подложка, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото.
Гибридизация-основа технологии
Основа всех современных ДНК-технологий – гибридизация. В результате гибридизации молекулы нуклеиновых кислот способны формировать устойчивые двухцепочечные структуры благодаря связям между элементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденин (А) комплиментарен тимину (Т), гуанин (Г) - цитозину (Ц). В результате одноцепочечная последовательность нуклеотидов АТГЦ будет образовывать стабильную ассоциацию, двухцепочечную структуру, с одноцепочечной молекулой ДНК состава ТАЦГ.
….. АТГЦ….
| | | |
….. ТАЦГ….
Подобная комплементарность приводит к «слипанию» двух молекул ДНК, одна из которых может быть неподвижно закреплена на подложке, и являться элементом ДНК-чипа. Чем больше содержится в образце молекул комплиментарных элементам чипа, тем больше их будет связываться с чипом, и тем выше будет интенсивность сигнала, воспринимаемого от данного элемента. На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А ) с тимином (Т ) и гуанина (G ) с цитозином (С ) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G , предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 4 20 =1.09х10 12 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ .
Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе. Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G , предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным.
Используемые для определения параметров гибридизации устройства позволяют регистрировать не только конечный результат, но и кинетику ассоциации и диссоциации комплементарных цепей. Эти технологии, делая возможным многопараметрический анализ образцов, могут предоставлять большое количество информации. Результаты гибридизации зависят от длины ДНК - пробы, химического состава меченой ДНК - мишени, температуры, при которой проводится гибридизация, состава гибридизационной смеси, типа флуоресцентной метки. Здесь необходимо отметить, что в ДНК-чипах в основном используется пассивная гибридизация, т.е. взаимодействие ДНК-мишени с иммобилизованной пробой является вероятностным процессом и зависит от различных условий.
Применение ДНК-чипов
Оценка состояния и идентификация всех генов исследуемого организма является одной из важнейших задач, поставленных перед разработчиками ДНК-чипов. Решение этой задачи может быть реализовано в иммобилизации всех генов организма на биологический чип, что позволит комплексно оценить состояние генов и генома в целом. Биогенетические базы данных, содержащие всю информацию (систематизированную) по генам и геномам различных организмов, представляют исследователям огромные возможности в дизайне ДНК-чипов.
К основным причинам широкого распространения биочиповых исследовианий относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства.
Подводя некоторые итоги нужно отметить, что микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако, когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, с чем постоянно и приходится сталкиваться в клинической практике, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, а основное достоинство такого вида ПЦР как Real Time, позволяют давать даже количественную оценку исследуемой матрицы. Это имеет важное значение для решения задач в области развития фундаментальных и интегральных наук, а так же оптимизации условий методов диагностики.
Итак, два метода, ставшие уже традиционными для некоторых областей науки и прикладных технологий, на ряду со своими недостатками имеют совершенно уникальные достоинства.
RealTime ПЦР:
· дает возможность оценивать количество исходной матрицы;
· не требует дополнительных трудоемких этапов работы;
· отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации и таким образом уменьшить число ложноположительных результатов;
· использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм;
· обеспечивает менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматической регистрации и интерпретации результатов;
· позволяет экономить время.
Биологические микрочипы:
· позволяют миниатюризировать образец и анализатор;
· экономит время и стоимость анализа;
· позволяет одновременно определять несколько параметров исследуемого образца;
· убладает высокой чувствительностью амплификационных методов, специфичностью и воспроизводимостью;
· обеспечивает простоту процедуры выполнения работы.
Возможно, что объединие этих методов за счет перевода полимеразной цепной реакции в формат микрочипов позволит создать диагностическую систему нового поколения, которую будут характеризовать следующие качества: более высокая чувствительность и, главным образом, специфичность определения нуклеиновых кислот, высокая производительность при низкой себестоимости выполнения анализа, общее сокращение количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа.
